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1967年底，尽管将军庆喜“奉还大政”予天皇，但仍与倒幕派发生军事冲突。新撰组参加了1868年1月的鸟羽伏见之战，许多组员战死，近藤勇等乘坐幕府军舰败退江户。其后受命组成甲阳镇抚队，在甲府迎击东上的政府军，但冷兵器不敌热火器，败走下总流山寻找机会，被包围后投降。1868年4月，近藤勇在江户板桥刑场被斩首，享年35岁。其后土方岁三率领新撰组残余势力继续转战东北各地，抵抗政府军。最后与幕府海军副总裁榎本武扬进入北海道箱馆，1868年12月虾夷共和国成立后，任陆军第二把手。1869年5月，政府军猛攻箱馆，土方中弹死亡，也是35岁。
在新撰组主要成员中，也有几位活下来。副局长助理永仓新八转战东北后逃回江户，隐名埋姓生活，后成为杉村家的养子，改名为杉村义卫。1874年，明治政府赦免阵亡的抵抗者，新撰组成员恢复权利。永仓后来到北海道任剑道教师，1915年去世，享年77岁，留下了《浪士文久报告记事》、《新选组颠末记》等宝贵史料。斋藤一战争后期化名山口次郎并移居青森县，后改名藤田五郎任职警视厅，退休后做东京教育博物馆的警卫，1915年去世时73岁。现在仍能查到新撰组成员的后人，例如冲田总司的后人冲田胜芳目前在东京任日立仓库的管理员，而土方岁三的后人土方康是日野市议员。